AlphaFold 3预测TCR抗原特异性

DRUG ONE T细胞受体（T细胞受体，TCR）通过识别主要组织相容性复合体（MHC）呈递的抗原肽，介导适应性免疫应答。尽管高通量测序已经能够大规模获取TCR序列，但如何准确预测其对应的抗原特异性仍是免疫学研究的重要挑战。现有计算方法大多依赖已知抗原的实验数据或结构信息，难以预测此前未被研究的抗原表位。研究人员利用AlphaFold 3（AF3）预测MHC–抗原肽–TCR三元复合物结构，建立了基于序列的通用抗原特异性预测方法。

研究覆盖超过9,000种具有实验支持的TCR–抗原配对，涉及1,000多个不同抗原表位及70多种MHC I类和II类等位基因。通过分析预测结构中的界面置信度、残基相互作用及分子对接特征，研究人员发现能够有效区分特异性识别与非特异性配对的结构指标。在独立验证数据集中，该方法对MHC I类和II类限制性抗原的预测AUC中位数分别达到0.92和0.81，并能够识别此前缺乏结构信息的抗原表位。

研究证明，利用AF3预测的蛋白质复合物结构，可以在不依赖特定抗原训练数据的情况下推断TCR抗原特异性，为大规模解析T细胞免疫应答提供了新的计算途径。适应性免疫系统需要在广泛识别外源性抗原的同时，保持对不同抗原的高度特异性。 T细胞通过TCR识别由MHC分子呈递的抗原肽，从而启动针对感染、肿瘤及其他免疫相关疾病的细胞应答。人体内存在超过一亿种不同的TCR，其理论序列组合更加庞大，使免疫系统能够识别种类极其丰富的抗原。

近年来，单细胞测序和高通量免疫组库分析技术使研究人员能够快速获取大量TCR序列，甚至直接确定TCR α链与β链的配对关系。然而，序列信息本身并不能直接揭示TCR识别哪些抗原。传统实验方法通常依赖抗原肽–MHC复合物探针、细胞激活实验或结合实验逐一验证，虽然部分技术已实现多重检测，但面对庞大的TCR序列空间仍存在明显的通量限制。计算预测方法主要包括两种路线。第一类基于TCR序列相似性，通过识别具有共同抗原特异性的序列簇推断未知TCR的功能，例如TCRdist、GLIPH和DeepTCR等。

这类方法能够发现具有相似识别特征的TCR，但通常需要针对每种抗原积累已知结合序列，难以推广至新的抗原表位。第二类方法利用蛋白质三维结构预测TCR与抗原肽–MHC复合物之间的相互作用。这类方法具有更明确的分子机制基础，但MHC–抗原肽–TCR三元界面具有极高的结构和序列多样性，准确预测TCR的结合方向及互补决定区构象一直十分困难。此前基于AlphaFold-Multimer的方法虽然取得一定进展，但主要适用于已有较充分研究的抗原体系。

AlphaFold 3引入新的结构生成和扩散优化机制，提高了多分子复合物的结构预测能力。研究人员因此提出，若AF3能够准确预测MHC–抗原肽–TCR三元复合物的空间结构，则可以进一步利用其界面特征，在不依赖已知抗原特异性训练数据的情况下判断TCR是否能够识别给定抗原，从而突破现有方法对已知表位的依赖。

方法研究人员首先从TCR3d和蛋白质结构数据库中收集284个具有实验结构的MHC–抗原肽–TCR三元复合物，包括214个MHC I类和70个MHC II类复合物，利用AF3预测三维结构，并通过互补决定区均方根偏差（CDR RMSD）比较AF3、AF-TCRdock和Boltz-2的预测精度。随后，从免疫表位数据库IEDB收集实验验证的TCR–抗原配对，通过序列同源性过滤减少与AF3预训练结构及独立验证集的重叠，并随机重组TCR与抗原构建非特异性配对对照。

研究从AF3预测结果中提取整体置信度、局部结构置信度、界面残基相互作用及对接几何等近50项特征，以不同抗原和研究组合为单位评价特异性识别能力，并选择表现最佳的界面预测排列误差指标构建分类模型。最后，使用AF3训练截止日期之后公布的PDB结构及独立CRESTA实验数据进行验证，同时分析不同实验类型、TCR结合亲和力和交叉反应性对预测性能的影响。

结果 AlphaFold 3能够高精度预测MHC–抗原肽–TCR三元复合物结构研究人员首先评估AF3对已知MHC–抗原肽–TCR三元复合物的结构预测能力，以确定其是否能够为抗原特异性识别提供可靠的空间信息。在284个具有实验结构的复合物中，AF3能够较好地恢复TCR α链与β链的配对、MHC分子的整体折叠，以及抗原肽在MHC结合槽中的位置。同时，模型能够预测TCR互补决定区与抗原肽及MHC分子之间的主要接触界面。研究人员进一步按照AF3训练截止日期，将实验结构划分为训练期间已公开和训练之后才公开的两组。

对于训练截止日期之前的结构，AF3在MHC I类和II类复合物上的CDR RMSD中位数分别为1.5 Å和1.8 Å；对于训练截止日期之后的结构，相应数值分别为3.2 Å和2.4 Å。与此前专门用于TCR复合物预测的AF-TCRdock相比，AF3在不同测试条件下均表现出更高的结构预测精度，CDR RMSD中位数改善约0.8–2.9 Å。虽然Boltz-2在训练截止日期之前的结构上具有优势，但在训练后公布的复合物上未能显著优于AF3，说明AF3在未知结构上的泛化能力较强。

进一步分析发现，AF3对TCR、MHC及抗原肽各组成部分的结构预测通常较为准确，大部分单独组分的RMSD中位数处于0.4–1.0 Å范围内。然而，TCR与抗原肽–MHC之间的相对结合方向仍是主要误差来源。研究还发现，AF3输出的界面预测模板建模分数（ipTM）与结构预测准确性显著相关，表明模型自身提供的置信度信息能够用于评估三元复合物的结合可靠性。这为后续直接利用结构置信度推断抗原特异性奠定了基础。图1|AlphaFold 3对MHC–抗原肽–TCR三元复合物的结构预测精度及置信度分析。

构建覆盖广泛抗原表位的TCR特异性预测数据集在验证AF3的结构预测能力后，研究人员进一步建立大规模TCR–抗原特异性分析数据集。由于现有PDB中具有实验结构的三元复合物数量有限，而且主要集中于少数研究充分的抗原，研究人员转而利用IEDB中积累的大量实验性TCR–抗原识别记录。经过实验记录筛选及序列同源性过滤，研究最终获得7,702个MHC I类特异性配对和1,625个MHC II类特异性配对，分别覆盖38种MHC I类等位基因及多个MHC II类等位基因组合。

为建立阴性对照，研究人员在相同数据库来源中随机交换TCR与抗原肽–MHC的配对关系，形成157,025个MHC I类和33,628个MHC II类非特异性配对。这些组合用于评估AF3是否能够区分实验上具有特异性识别关系的TCR与随机配对的TCR。考虑到数据库中不同抗原和研究的样本数量差异很大，研究人员没有直接将全部配对混合评价，而是以特定研究中的特定抗原为单位计算分类性能。经过整理，MHC I类和II类数据分别包含1,024个和248个抗原–研究组合。

此外，研究设置了独立验证数据集，包括16个MHC I类特异性配对及181个阴性对照，以及205个MHC II类特异性配对及1,228个阴性对照。研究通过严格的序列相似性排除策略，降低训练数据重叠对模型评价的影响。这一数据集不仅覆盖了较广泛的TCR和抗原多样性，也为比较不同实验来源的识别可靠性提供了基础。图2|TCR抗原特异性预测模型的训练与独立验证数据集构建流程。

AF3预测的界面特征能够区分特异性与非特异性TCR配对研究人员随后利用AF3对大规模阳性与阴性三元复合物进行结构预测，并从预测结果中提取多种反映结合可靠性的特征。这些特征包括整体结构置信度、抗原肽及TCR局部区域的预测质量、界面残基之间的预测排列误差，以及TCR相对于抗原肽–MHC复合物的空间对接几何参数。研究共分析了MHC I类47项和MHC II类48项特征。结果显示，绝大多数特征与TCR是否识别对应抗原存在显著关联。

其中，MHC I类47项特征中的46项以及MHC II类48项特征中的44项具有统计学显著性，说明AF3预测结构不仅能够反映复合物的几何合理性，还包含与抗原特异性相关的信息。在不同特征中，TCR与抗原肽–MHC界面的预测排列误差表现尤为突出。通常情况下，具有真实识别关系的复合物在关键界面上的预测误差更低，表明AF3对其相对空间排列具有更高置信度。研究人员还尝试使用随机森林和XGBoost组合多个结构特征，但这些复杂分类器并未持续优于最佳单一指标。

考虑到模型复杂度和过拟合风险，最终选择TCR–抗原肽界面预测排列误差构建AF3-PTI-PAE分类方法。该方法无需针对每个抗原分别训练识别模型，而是直接根据AF3预测的界面置信度对候选TCR进行排序。这表明，三元复合物结构预测本身可以为抗原特异性推断提供具有一定通用性的判别信号。图3|AF3预测结构中的界面特征与TCR抗原特异性之间的关联分析。 TCR特异性预测性能受到实验方法与结合亲和力影响为进一步理解模型性能差异，研究人员根据IEDB中用于确定TCR–抗原识别关系的实验类型，对预测结果进行了分层分析。

结果发现，不同实验方法对应的预测性能存在明显差异。对于通过直接结合实验确认的TCR–抗原配对，AF3-PTI-PAE在MHC I类和II类体系中的AUC中位数分别达到0.93和0.94，表现出较强的识别能力。表面等离子共振实验对应的MHC I类数据也获得0.85的AUC。相比之下，基于MHC多聚体或四聚体染色获得的配对数据表现较弱，其MHC I类和II类AUC中位数分别为0.61和0.52。

相比之下，基于MHC多聚体或四聚体染色获得的配对数据表现较弱，其MHC I类和II类AUC中位数分别为0.61和0.52。相比之下，基于MHC多聚体或四聚体染色获得的配对数据表现较弱，其MHC I类和II类AUC中位数分别为0.61和0.52。